Het verhaal is een prequel van de videogame Assassin's Creed II. Het draait om de vader van de hoofdpersoon van het spel, Ezio Auditore da Firenze. Giovanni is een assassin die tijdens de Renaissance in het 15e eeuwse Italië leefde. Bij het aanbreken van een nieuw tijdperk wordt door een corrupte familie een samenzwering uitgezet om de machtige Medici-familie omver te werpen en een verenigd Italië te vernietigen. Als een assassin moet Giovanni deze dreiging het hoofd bieden en gerechtigheid brengen. Het verhaal introduceert de situatie vóór Assassin's Creed II en de vijanden van beide personages.