Die Handlung von Mitsuboshi Colors findet an einem bestimmten Ort eines bestimmten Parks im Ueno-Gebiet von Tokio statt. An diesem Ort steht die geheime Basis der Gerechtigkeitsorganisation, genannt „Colors“. Die drei Grundschülerinnen Yui, Sacchan und Kotoha führen die „Colors“ an. Die Mitglieder der Gruppe durchstreifen den Park Tag und Nacht (eigentlich nur bis zum Abend), um den Frieden des Parks zu schützen.