Dr. William Masters, ein führender Gynäkologe an der Washington University in St. Louis, beobachtet Prostituierte bei der Ausübung ihres Gewerbes, um Daten über die körperlichen Vorgänge während des Geschlechtsaktes zu sammeln. Rektor Scully weigert sich allerdings, seine Pläne für ein Forschungsprojekt zu diesem Thema innerhalb der Universität zu unterstützen.
Auf der Suche nach einer Assistentin, die mehr von weiblicher Sexualität versteht als er selbst, wird Masters auf die geschiedene, alleinerziehende Mutter Virginia Johnson aufmerksam. Diese hat eine Affäre mit Masters’ Assistenzarzt Ethan Haas.
Ohne Genehmigung durch die Fakultät beginnen Masters und Johnson, Probandinnen in der Klinik mit Messgeräten zu überwachen, während diese masturbieren. Doch damit möchte sich Masters nicht zufriedengeben..
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